柱式质粒DNA大提试剂盒(100～300mL)

产品货号：

BTN80912

中文名称：

柱式质粒DNA大提试剂盒(100～300mL)

英文名称：

Column Max Plasmid DNA Extraction Kit(100-300mL)

产品规格：

5次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒是用于质粒DNA大量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处理，再通过离心吸附柱，专一结合DNA，最后洗去杂质，高效快速提取质粒DNA，全套操作可以在30分钟之内完成。使用本试剂盒纯化得到的高纯度质粒DNA，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。

试剂盒特点：

快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。
纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8～2.0之间。
产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到2～5μg/mL。
用途广，适用于低拷贝和高拷贝质粒。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	26mL
溶液B	26mL
溶液C	36mL
RNase A溶液(10mg/mL)	0.6mL
大提离心吸附柱	5套
通用洗柱液	100mL
DNA洗脱液2.0	10mL

储存条件：
RNase A溶液需-20℃保存，其余成分可室温或4℃保存。
如有沉淀可加热溶解后再使用。

注意事项：

细菌培养时间一般为12～16小时，但接种量大时应减少时间。过度培养会降低质粒的质量甚至导致质粒DNA突变。
溶液A:溶液B:溶液C的比例为3:3:4。若细菌量增大，需按此比例放大这些溶液的使用量。
随菌体增多应延长溶液B的作用时间，直至溶液成粘稠透明状。但时间过长会导致质粒DNA变性。
加溶液C后形成的白色沉淀中有变性的蛋白质、细菌基因组DNA和细胞碎片，离心后应避免带入到后续处理中。
通用洗柱液洗涤离心柱后必须甩干一次，否则残留通用洗柱液中的乙醇会干扰后续实验。
质粒的具体产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。100mL高拷贝的菌液一般能得到700～1500μg质粒DNA，100mL低拷贝的菌液一般能得到150～350μg质粒DNA。
纯化的质粒在电泳中表现为2～3条带有时甚至为4～6条带均属正常，未分开的环套质粒，易被误判为基因组DNA。

使用方法：

用250mL离心管收集100～300mL菌液，5000rpm离心10分钟，去除上清。
往细菌沉淀中加入5mL溶液A，充分振荡悬浮（第一次使用时需要将RNase A溶液全部加入到溶液A中并混合均匀，未用完的、含RNase A的溶液A需放4℃保存）。
注意：充分重悬细胞沉淀使之无细胞结块状物对于获得高的质粒产量十分重要。
加入5mL溶液B，温和翻转10余次至蓝色变得均匀。室温放置5～10分钟裂解细菌。
注意：避免剧烈振荡，否则细菌基因组DNA将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且速跟厂家联系。
加入冰浴的7mL溶液C，颠倒混匀，此时混合液应该从蓝色变成无色，如果不发生颜色变化，则表示溶液C变质，需要联系厂家。将混合液冰上放置10分钟，将有白色絮状物形成。注意不要过分振荡。
6000rpm离心10分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。
将上清液（约20mL）转移到离心吸附柱中，放入50mL套管中。由于此时的溶液比重较大，部分沉淀物悬浮在上清液中属正常，吸取上清时避开漂浮的沉淀物即可。
6000rpm离心5分钟，质粒DNA将与离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。
将10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟，弃穿透液。
重复上步一次，即将10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟，弃穿透液。
室温6000rpm空甩5分钟，弃穿透液。注意：此步对去除残留通用洗柱液很重要，否则通用洗柱液会影响DNA的使用。
将离心吸附柱放入一个自备的、干净的50mL塑料离心管中，加0.5mL DNA洗脱液2.0（洗脱液如加热到50～65℃效果更佳），室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟，收集液即是质粒DNA溶液。
本试剂盒中的离心吸附柱吸附能力较强，所以再用1mL DNA洗脱液2.0洗脱3～4次才能把绝大部分质粒DNA洗脱下来。得到的RNA可以收集在一起立即使用或存放于-80℃待用。
注：
① 如果DNA洗脱液不够，可以用自备的DEPC水代替。
② 一般情况下，第一次洗脱可以洗脱约25%的质粒DNA；第二次洗脱可以洗脱约35%的质粒DNA；第三次洗脱可以洗脱约20%的质粒DNA；第四次洗脱可以洗脱约10%的质粒DNA；第五次洗脱可以洗脱约8%的质粒DNA。
合并所得质粒DNA，立即使用或-20℃储存。如果需要使用液相内毒素清除剂清除质粒DNA中的内毒素，可以直接将此步所得的DNA溶液用于去内毒素处理。如果DNA浓度太低，可以另购本公司的核酸浓缩剂进行浓缩。

疑难解答：

质粒DNA中有基因组DNA污染
- 加入溶液B后剧烈振荡了细胞裂解液
  - 加入溶液B后不要猛烈振荡或搖匀，可轻轻颠倒离心管几次使充分混匀。
质粒DNA产量低
- 细菌裂解率低
  - 在加入溶液A后细菌沉淀没有充分混匀，可漩渦振荡悬浮液使之充分混匀，不要有块状物。
  - 加入溶液B后，延长孵育时间可获得清晰的裂解液。
  - 如果装溶液B的瓶子没有盖紧，溶液B可能失效，需按以下配方重配：0.2N NaOH，1%SDS。
- 细菌培养物生长时间过长或不新鲜
  - 不要于37℃培养超过16小时，不要在分离质粒前长时间存放细菌培养物。
电泳上样时，质粒DNA漂出点样孔
- 质粒DNA中有残留的乙醇
  - DNA洗脱前离心柱必须干甩一次。

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